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ApoE基因多態(tài)性檢測試劑概述

  • 時(shí)間:2024-11-05

(原創(chuàng) 2023-04-20 CMDE 中國器審)

  載脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE) 是血漿脂蛋白的重要組成部分,參與血漿膽固醇、甘油三脂的運(yùn)輸及代謝過程,在脂類代謝及維持膽固醇平衡等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,是脂類代謝和心血管疾病的決定因子。ApoE還參與激活水解脂肪的酶類,并有免疫調(diào)節(jié)、參與神經(jīng)組織的再生及抑制血小板聚集等作用。

  一、ApoE基因多態(tài)性概述

  ApoE是由299個(gè)氨基酸組成的磷脂糖蛋白,分子量約為34kD,主要存在于乳糜微粒及其殘骸、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和部分高密度脂蛋白表面,少部分在血液中與ApoAⅡ形成復(fù)合體。ApoE主要由肝臟中的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和腦組織中的星形膠質(zhì)細(xì)胞合成,未與脂質(zhì)結(jié)合時(shí)被凝血酶分解為兩個(gè)單獨(dú)的結(jié)構(gòu)區(qū)域,N端區(qū)和C端區(qū)。N端具有結(jié)合脂質(zhì)和受體的功能;C端具有調(diào)節(jié)組織細(xì)胞攝取脂質(zhì)的能力,起調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝平衡的作用。

  ApoE基因位于人類第19號(hào)染色體長臂上,由3597個(gè)核苷酸組成,屬于常染色體顯性遺傳基因,具有顯著遺傳多態(tài)性。ApoE基因的基因型由兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(即526C>T和388T>C)決定,包含3個(gè)等位基因:E2(388T-526T)、E3(388T-526C)、E4(388C-526C),其中E3為野生型基因,E2和E4為突變型基因,共產(chǎn)生3種純合子(E2/2、E3/3、E4/4)和三種雜合子(E2/3、E2/4、E3/4)。

  ApoE基因三種等位基因堿基序列差異引起的氨基酸變化及蛋白質(zhì)構(gòu)象改變,使得三種異構(gòu)體與受體的親和力不同,最終導(dǎo)致不同表型的ApoE在人體代謝中發(fā)揮不同的作用。研究表明,ApoE的基因多態(tài)性與個(gè)體血脂水平及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。E2等位基因攜帶者血液中ApoE濃度高,膽固醇含量低,對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有防護(hù)作用;而E4等位基因攜帶者血液中ApoE濃度低,膽固醇及三酰甘油含量高,是動(dòng)脈粥樣硬化的潛在危險(xiǎn)因素。另外,多項(xiàng)研究表明ApoE基因多態(tài)性是他汀類藥物調(diào)脂療效出現(xiàn)個(gè)體差異的重要原因之一,E2等位基因攜帶者對(duì)于他汀類藥物的療效優(yōu)于E3、E4等位基因攜帶者,基因型為E2/2的高血脂癥患者建議選用普伐他汀治療,以提高降脂療效。

  檢測ApoE基因多態(tài)性,有助于臨床醫(yī)生準(zhǔn)確分析患者ApoE基因型,可為相關(guān)的疾病如高脂血癥、冠心病、阿爾茨海默癥等產(chǎn)生的原因提供參考,同時(shí)也為患者合理有效的使用他汀類藥物提供依據(jù)。

目前檢測ApoE基因多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要有:直接測序法、高效液相色譜法(DHPLC)、PCR-芯片雜交法、限制性片段長度多態(tài)性檢測法(PCR-RFLP)、PCR-金磁微粒層析法、熒光PCR法、PCR-溶解曲線法、飛行時(shí)間質(zhì)譜法等。

  二、ApoE基因多態(tài)性檢測試劑的上市批準(zhǔn)情況

  依據(jù)我國《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》,ApoE基因多態(tài)性檢測相關(guān)試劑屬于“與人類基因檢測相關(guān)的試劑”,應(yīng)按照第三類產(chǎn)品進(jìn)行管理。截止2023年1月,我國已批準(zhǔn)了8個(gè)ApoE基因多態(tài)性檢測試劑相關(guān)產(chǎn)品,檢測的基因位點(diǎn)均為526C>T和388T>C,適用樣本類型均為全血,檢測方法涉及熒光PCR法、PCR-芯片雜交法、PCR-RFLP法等,用于檢測ApoE基因526C>T和388T>C位點(diǎn)的基因多態(tài)性。

  三、ApoE基因多態(tài)性檢測試劑的審評(píng)關(guān)注點(diǎn)

  (一)企業(yè)參考品設(shè)置

  企業(yè)參考品的樣本類型應(yīng)與待測樣本一致,可采用臨床樣本或其提取的核酸。陽性參考品和檢出限參考品應(yīng)包含每一位點(diǎn)的純合突變型、雜合突變型和野生型;陰性參考品應(yīng)考慮檢測特異性評(píng)價(jià),納入同源序列交叉反應(yīng)樣本和干擾樣本。重復(fù)性參考品應(yīng)至少包含雜合突變型樣本。

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  可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測,確定適當(dāng)檢出率水平下的最低人基因組DNA濃度,作為檢出限濃度。同時(shí),該類產(chǎn)品的檢出限研究還應(yīng)評(píng)價(jià)試劑在確定檢出率水平下,可準(zhǔn)確檢出人基因組DNA濃度的上限。研究用樣本應(yīng)至少包含雜合型突變樣本。

  (三)分析特異性

  需針對(duì)可能存在的內(nèi)源和外源性干擾物進(jìn)行充分驗(yàn)證,同時(shí)應(yīng)針對(duì)同源序列其他位點(diǎn)序列突變進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證,并說明交叉反應(yīng)樣本的制備方法和核酸序列確認(rèn)方法。

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  該類產(chǎn)品的陽性判斷值研究應(yīng)考慮人種差異,納入不同民族或種族的樣本,同時(shí)應(yīng)涵蓋所有突變位點(diǎn)的野生型和突變型,采用受試者工作特征(ROC)曲線的方式進(jìn)行研究。如果試劑判讀存在灰區(qū),還詳細(xì)應(yīng)說明灰區(qū)范圍的確定方法。

  四、小結(jié)

  近年來隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,申報(bào)ApoE基因多態(tài)性檢測產(chǎn)品的企業(yè)越來越多,且有采用直擴(kuò)熒光PCR法等新方法的檢測產(chǎn)品申報(bào)注冊(cè),有必要對(duì)審評(píng)過程中需要關(guān)注的重點(diǎn)問題進(jìn)行總結(jié)和規(guī)范,為相關(guān)申報(bào)企業(yè)在設(shè)計(jì)開發(fā)此類產(chǎn)品和準(zhǔn)備注冊(cè)申報(bào)資料時(shí)提供有效指導(dǎo),同時(shí)也為注冊(cè)審評(píng)提供參考依據(jù)。


參考文獻(xiàn):

[1]周宏灝,陳小平,張偉等. 藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測技術(shù)指南(試行).實(shí)用器官移植電子雜志,2015,3(5):257-267.

[2]胡艷清,馬建群.載脂蛋白E基因多態(tài)性與心血管疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2018,58(1):106-108.

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